鸡传染性法氏囊病（IBD）是危害雏鸡的一种急性、高度接触性传染病。该病病毒以侵害鸡的中枢免疫器官法氏囊为主，从而导致免疫抑制或免疫不全，引起鸡只的大量死亡，给养鸡业带来了严重的经济损失。“黄连解毒汤”为古代药学名著《外台秘要》中的经典药方，为清热解毒的代表方剂，临床应用比较广泛，该方在人类疾病防治中也被广泛应用，但是整方用于畜禽的治疗中还未见报道，笔者通过将本方用于雏鸡法氏囊病的治疗，以探讨其在畜禽生产中的应用。

 

1         材料和方法

 

1.1.1          试验鸡  购入1日龄健康肉雏，隔离饲养于洁净动物舍，不做任何免疫接种饲养至32日龄，经检测IBD阴性。

 

1.1.2              IBD地方毒株  由邯郸地区采取具有典型病变的法氏囊毒，IBDV高免卵黄抗体由本校动物医院提供，抗体效价为1/128，IBDV标准阳性血清由哈尔滨兽医研究所生产

 

1.1.3   传染性法氏囊病毒稀释液  取具IBD明显症状的病鸡脾脏制悬液（1∶5），经离心后取上清夜加青霉素和链霉素作用6 h，冷藏备用。 

 

1.1.4   病毒鉴定：取IBDV标准阳性血清与病料悬液行11日龄鸡胚中和试验，结果呈“阳性”，另取病料悬液1 ml滴鼻感染3-4周龄易感鸡，鸡感染48 h后开始表现症状，剖检可见传染病法氏囊病眼观特征，取法氏囊组织制成病理切片后，可见明显的法氏囊病特征性变化 。   

 

1.1.5   黄连解毒汤：黄连 黄芩 黄柏 栀子 金银花 连翘等加6倍量水浸泡2 h后煎煮，用4层湿纱布过滤，压干药渣，药渣加3倍量水煎30 min过滤药渣，合并两次药夜，文火浓缩至中药含量为1 g/ml左右，高温灭菌4℃冰箱保存备用。

 

1.2.1              人工致病治疗试验  将54只SPF鸡随机分成为3组，每组18只，A组为黄连解毒汤制剂治疗组，B组为IBD卵黄抗体治疗组，C组为对照组，对3组鸡同时用IBDV染毒，每只鸡用IBDV强毒滴鼻0.2 ml，待出现临床症状后，给1组口服黄连解毒汤剂1.5 ml/只，每天两次，II组鸡为肌肉注射抗IBD卵黄抗体1ml/只，C组鸡注射生理盐水1ml/只，然后观察鸡的发病死亡及病理变化，并详细记录

 

1.2.2   抑制IBD致鸡胚致病试验  试验时先将病毒液作倍比稀释，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚10枚，每枚0.2ml，将黄连解毒汤制剂分别做1∶2，1∶4倍量稀释，并将不同稀释度药液分别与适量备用病毒液等体积混合，37℃作用1h分别经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚各10枚，每胚0.2 ml，同时作PBS对照，然后37.5℃继续孵化鸡胚，每12小时照蛋1次，并记录死亡情况，直至108h试验结束。

 

1.2.3   临床治疗试验  选典型IBD自然发病鸡群随机分成2组，一组肌注琼扩效价为1∶128的高免卵黄液，一组口服黄连解毒汤制剂1.5 ml/只。

 

2           实验结果

 

表1 黄连解毒汤制剂治疗IBD试验结果

 

 

2.1  人工致病治疗效果   染毒24 h后，试验鸡开始出现临床症状：精神不振，呆立不动，羽毛蓬乱，排黄绿色稀便，饮食减少或废绝。用药后，A组B组鸡从第2 d病情开始好转，第3、4 d有死亡鸡只出现，5 d后存活的鸡只基本康复，C组在出现症状第2天后病情恶化，开始出现死亡，第3-5 d达到死亡高峰，未死亡鸡第6 d后自愈。

 

      由表1可见，黄连解毒汤试验组治愈率为83.3%比IBD卵黄抗体组治愈率高15.4%，差异显著（P<0.05），而C组的存活率仅为22.2%。   

 

    对各组死亡鸡逐渐进行病理学剖检，从剖检情况看，几乎所有死亡鸡法氏囊浆膜水肿乃至胶冻样；泄殖腔有散在出血点，股部、胸肌、腿肌大腿内侧出血；心包积液，冠状沟出血；肾肿大，时间长的病例，尿酸盐沉积明显；腺胃有出血斑，法氏囊黄白色肿大，大多数充血出血明显。A组死亡鸡出血较轻，尤其是胃肠道和法氏囊变化不明显。

 

2.3  抑制IBD致鸡胚致病效果  一般认为，鸡胚接种后24 h以内死亡者应与病毒作用无关，试验结果见表2。

 

表2 黄连解毒汤抑制鸡胚死亡情况

 

 

    由表可见，黄连解毒汤制剂组死胚率分别为20%，30%，而病毒液组死胚率为80%，表明黄连解毒汤剂制剂组胚胎死亡率明显低于病毒液对照组（P<0.05或P <0.01），说明黄连解毒汤制剂对胚胎有着较好的保护作用。

 

2.4  临床治疗结果  对选定典型的发病鸡群黄连解毒汤平均治愈率为90.6%，平均给药次数为4-7次。

 

表3  IBD自然发病鸡群治疗效果

 

 

由表3表明黄连解毒汤对鸡传染性法氏囊病的治疗效果较高免卵黄抗体略好，但治愈率差异不显著（P>0.05）

 

3           讨论

 

3.1  上述试验结果表明，黄连解毒汤用于预防和治疗IBD有着明显的效果。从表1看出在对照组死亡率达77.8%的情况下，黄连解毒汤治疗组治愈率为83.3%，降低死亡率61.1%，临床疗效显示黄连解毒汤制剂治疗IBD治愈率为90.2%，比试验室高7%。

 

3.2   天然中草药防治病症的基本原理是扶正祛邪，即保证健康的正常的生理功能和消除治病因素来增强抗病能力，其在抗微生物的作用方面也是这个道理。黄连、黄芩、黄柏分别泻心火、肺火、肾火，清化湿热，对一切火热只盛，疮黄肿毒有显著疗效。体外试验证明黄连对肺炎双球菌、霍乱弧菌、炭疽杆菌以及金黄色葡萄球菌有较强的抑菌作用，并对各型流感病毒、法氏囊病毒、新城疫病毒有较强的抑制作用；黄芩能抗炎抗变态反应，并且有很广泛的抗菌谱，对多种病菌以及流感病毒有较强作用；黄柏清热燥湿、泻火解毒，抑制疮疡肿毒；金银花不仅具有较强抗菌作用，而且有丰富的维生素P，能增强毛细血管的致密度，防止毛细血管破裂出血和皮下溢血有着明显的疗效，因此，黄连、黄芩、黄柏、栀子、金银花、连翘配伍具有广泛的抗菌和抑制病毒作用，对雏鸡法氏囊病有较好的疗效。

 

另外试验已证明中草药对细菌产生的内毒素和外毒素有中和破坏作用，能增强机体的防御功能、增强细胞的吞噬作用，促进淋巴细胞的转化作用，从而提高机体的抗感染力，同时有助于改善消化机能，促进食欲增强体质，因此可以认为黄连解毒汤具有抗菌解毒、提高免疫力、增强体质等功能，但是具体作用机制尚需进一步探讨。

 

参  考  文  献

 

[1].陆峰，等.卵黄抗体防治鸡传染性法氏囊病. 中国兽医杂志，1992，18（3）：14

 

[2].王译霖，等.人工感染不同IBDV毒株对新城疫免疫效果的影响.中国畜禽传染病，1993，

 

    （2）：5～6

 

[3].祝建新，等.中草药防治鸡人工感染传染性法氏囊病的试验研究.中兽医学杂志，1994，（2）：1～5

 

[4].董发明，等.中草药防治传染性法氏囊病试验.中兽医医药杂志，1997，（6）：10～11

 

[5].杜爱芳，中药对人工感染IBDV鸡产生免疫抑制的调节作用.中兽医医药杂志，2000，19（3）：5～7

 

[6].包慧芳，等.囊速康防治鸡传染性法氏囊病的试验.中兽医医药杂志，2000，19（2）：3～6

 

[7].余建国.等，黄芪多糖增强雏鸡对传染性法氏囊病抵抗力的研究.中兽医医药杂志，2000，19（6）：3

 

[8].谢仲权主编，天然物中草药饲料添加剂研究方法，北京：中国农业出版社 ，2001

 

[9].李向中主编 ，中医学基础， 第二版 ，北京：人民卫生出版社，1989

 

[10].欧守杼主编，  畜牧微生物学，第三版，北京：中国农业出版社，1997

 

[11].甘孟候等主编 ，禽病诊断与防治， 中国农业科技出版社，1996

 

附作者简介：祝国强 男  满族  讲师  在读药学硕士

 

Experimental study on IBD prevention and control of  Huanglianjiedutang

 

                   Zhu Guoqiang

 

（Handan Agricultural College，Yongnian HeBei， 057150）

 

 Effects of  Huanglianjiedutang on prevention and comtrol IBD and on restraining death of chick embryo induced IBD artificially were observed 。The results showed：The curative rate of  Huanglianjiedutang for infected chickens was 83.3%，and the curative rate of  Huanglianjiedutang for diseased chickens  in the practice  was 90.2%. The effects of controlling death of chick embryo induced IBD artificially was obvious.

 

  Key ： Huanglianjiedutang   IBD   Chick embryo

饲用活性多肽类添加制技术问世

     一种不含任何激素、抗生素、瘦肉精，不也不含毒害物质，既能有效地促进畜禽的正常健康生长，同时又增加个体抗病能力并具有双向调节功能的“饲用活性多肽类添加剂”，已由华东理工大学教授雷国雄等科研人员研制成功。该项目技术属国内首创，已达到国际同类产品的先进水平。

    该绿色添加剂是以深海鱼粉为底物，进行低温酶解并采用与多种微量元素螫合的独特技术，生成的酶解液再被载体所吸附，经混匀、干燥而形成一种全新的饲用多肽添加剂。该添加剂属绿色添加剂，它无毒、促生长、抗病害，对防止病害的传播、发生具有重大意义，而且无污染排放物产生。

    这种添加剂成本低廉，每吨普通饲料中只需加人50元左右成本的添加剂，比原定指标下降40～50％。同时提高了肉猪、肉鸡的净重率和蛋鸡的产蛋率，具有显著的经济效益。

 

来源：三农在线

 

绿色饲料添加剂抗菌肽的研究进展

     田萍 姚武群
     （广东佛山科学技术学院动物科学系 南海大沥 528231）
     摘要:抗菌肽是哺乳动物防御体系的一个重要组成部分,具有分子量小,热稳定性好,无免疫原性,抗菌谱广等特点。对畜禽具促生长、保健和治疗疾病的功能，且无毒副作用、无残留、无致细菌耐药性。本文就抗菌肽的分类、抗菌机理、应用效果及作为饲料添加剂的应用优势等方面进行了综述。
     关键词:抗菌肽; 饲料添加剂;作用机理;应用效果　　
     随着抗生素的大量广泛用于饲料中和人们对食品和环境质量的要求越来越高，人们对抗生素的副作用认识日益加深，抗生素在饲料业中的应用，已面临着淘汰或禁用的局面。应用无毒无公害的新型抗菌剂代替抗生素作饲料添加剂，已成为当前国内外饲料学科的一项重要内容。随着我国进入WTO，抗生素作饲料添加剂必将严重影响畜产品在国际市场的竞争力，应用生物技术研究与开发新型抗菌剂是我国饲料科学界一项紧迫的任务。
     抗菌肽具广谱抗菌作用，对畜禽具促生长、保健和治疗疾病的功能，属无毒副作用、无残留、无致细菌耐药性的一类环保型制剂。可应用生物工程的技术方法生产抗病菌的转基因动植物产品,同时可以通过基因工程的技术方法大量的表达抗菌肽,使之成为新一代肽类抗菌药的来源，具有出广阔的应用前景。
     1　抗菌肽的分类
     1 .1　哺乳动物抗菌肽 哺乳动物抗菌肽广泛存在于嗜中性白细胞、粘膜和皮肤等。例如,在猪肠中存在富含pro-arg,相对分子质量为471 9ku的PR-39肽、Cecropin P1、有78个氨基酸残基的NK-lysin、在猪白细胞中分离出 5个小分子抗菌肽,它们仅含16～18个氨基酸残基;在绵羊中至少已发现10种抗菌肽基因;牛中至少已发现30种抗菌肽;另外,牛奶中也分离到3种抗菌肽,它们具有抑制肠毒性大肠杆菌,单核细胞增多性李氏杆菌的生长。
     防御素是哺乳动物中研究最多的抗菌肽,包括两大类:α-防御素和β-防御素。主要存在于哺乳动物的白细胞、吞噬细胞或小肠的潘氏细胞中,特别是在嗜中性白细胞中。防御素通常由2 7～54个氨基酸残基组成,通过保守半胱氨酸构成3个稳定的链内二硫键使肽环合形成稳定的反向平行的β片状结构。哺乳动物防御素具有保守的6个半胱氨酸, 能形成3个稳定的链内二硫键,这也是区别其他抗菌肽的主要特征之一。防御素抗微生物谱比较广泛,包括革兰氏阳性菌和阴性菌、分枝杆菌、螺旋体、真菌和一些被膜病毒,此外,对恶性细胞也具有毒杀作用。
     1.2昆虫抗菌肽 从天蚕的免疫血淋巴中分离得到的高效抗菌肽Cecropins是最早发现的抗菌肽。此后在许多昆虫中也鉴定出有Cecropins或类似分子。Lee等在猪的肠中也发现了一个Cecropin,这可能暗示Cecropins广泛存在于动物中。
     Cecropins 对各种大肠杆菌和其他革兰氏阴性细菌,如沙门氏菌,具有很强活性,且对某些革兰氏阳性菌也具有杀伤活性,但对霉菌和其他真核细菌无细胞毒性作用。 Cecropins为一线性阳离子肽家庭,链长35～40个氨基酸残基,而Ｃ-末端最后一个残基的羧基酰胺化。Cecropins的ｃDNA序列分析显示其前体分子含62～64个氨基酸残基,而Ｃ-末端最后一个残基的羧基酰胺化。Cecropins的ｃDNA序列分析显示其前体分子含62～64个氨基酸残基,具有保守的信号序列和前导序列。该基因在蚕中有3个;果蝇中有4个。损伤和感染时诱导该基因表达。如注射细菌碎片或LPS后几小时内昆虫脂肪细胞中特异性ｍRNA大量增加,24ｈ内即可在血淋巴液中检测出Cecropins。天然免疫细胞膜受体识别微生物成分后,通过Toll通路而激活NF-KB样子。
     蜂毒溶血肽是蜜蜂毒液中的一种多肽,由26个氨基酸残基组成,其分子量为2480Ｄ。蜂毒溶血肽可直接与红细胞的膜脂作用具有较强的溶血作用。Apila是从蜜蜂体液中提取的一种短肽,由18个氨基酸组成,具有高效广谱的抗菌作用而对真核细胞无毒性。
     1.3 蛙类抗菌肽 Zaslff在非洲爪蟾皮肤中发现了小分子抗菌肽,称为Magainins。此后相继发现了多种蛙类抗菌肽,如在非洲爪蟾中就有十多种抗菌肽,不仅在皮肤颗粒腺表达,也有存在于胃粘膜和小肠道细胞。蛙类抗菌肽具有协同效应,但不同的蛙类抗菌肽很少具有同源性。
     1.4植物抗菌肽 Thionins是最早从植物中分离的抗菌肽。它们对革兰氏阳性菌、阴性菌、真菌、酵母及哺乳动物细胞均有毒性。其他一些结构上与昆虫、哺乳动物防御素结构相似的植物抗菌肽,称为植物防御素。
     1.5细菌抗菌肽 细菌抗菌肽包括阳离子肽和中性肽,革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有分泌。例如乳酸链球菌肽是由乳球菌产生的含3～4个氨基酸残基的短肽,它是一种耐酸性物质,即使在胃这样低ｐＨ环境中稳定性也很高,能抑制革兰氏阳性菌如梭状芽孢杆菌和李氏杆菌。
     2 抗菌肽的抗菌机理抗菌肽具有广谱杀菌作用,抗菌作用主要是由于在两亲性的α螺旋结构作用下,使原核细胞质膜上形成离子通道,这种通道的直径经推算大约为 4nm,离子通道的形成改变了细胞内外的渗透压,使细胞内物质大量外渗,起到杀菌作用。姜明等通过电镜观察了柞蚕抗菌肽对大肠杆菌的作用,发现经一定时间的作用后,在细菌外壁形成了喇叭状缺口,这说明抗菌肽分子是以一端插入细菌细胞膜,通过“打孔”形成一个通道,使细菌细胞膜破裂,原生质“泄漏”而死亡。从这点看,抗菌肽的正电荷与细菌胞膜的磷脂头负电荷间的作用至关重要,在肽分子中N端α螺旋的双亲性是裂解细菌的主要部分,C末端的酰胺化与广谱抗菌有关。从而可看出抗菌肽的抗菌机理与通过阻断大分子的生物合成来发挥作用的抗菌素的抗菌机理完全不同,且病原菌不易对其产生耐药性,因此该物质将成为新抗菌药的来源.。
     3 抗菌肽的应用研究
     3.1在畜牧业上的应用仔猪腹泻、奶牛乳房炎及各种病毒性疾病如猪瘟、鸡新城疫等一直是棘手的疾病,不利于畜牧业的发展。借鉴已成功的昆虫抗菌肽转基因工程,如转基因蚊子、转基因马铃薯、转基因水稻等,把特异的抗菌肽基因转入畜禽特定细胞让其表达,从而产生抗病新品种。据美国学者报道，抗菌肽可以作为饲料防霉剂。另有报道，柞蚕抗菌肽应用于预防及治疗鸡的白痢效果明显。应用含抗菌肽的柞蚕免疫血淋巴粉添加于断奶仔猪料，饲喂试验结果表明，蚕抗菌肽可减轻断奶仔猪的腹泻。
     温刘发等(2001)报道,通过50 L发酵罐培养中间试验，在优化发酵条件后，用甲醇诱导启动醇氧化酶启动子而成功表达抗菌肽基因并分泌抗菌肽到菌体外，培养液中抗菌肽的杀菌活力达5000 单位／ml。进一步改进培养基配方，掌握较适宜的培养条件，包括PH、温度、供气量及搅拌速度等，发酵生产周期可缩短到24h，杀菌活力达5600单位／ml。以这些工程酵母发酵液作试验，通过饮水摄入剂量为60u／只?d的粤黄鸡饲养试验结果表明，抗菌肽可促进小鸡生长和减少排泄物氮含量,对粤黄鸡具有促生长、保健和治疗疾病的功能。蚕抗菌肽酵母制剂作饲料添加剂的应用效果显著。
     3.2药用随着传统抗生素的广泛及长期的应用,许多病源菌对它们产生了耐药性,而具有广谱抗菌且有独特的抗菌机制的抗菌肽显然在这方面的应用研究中具明显优势。随着对抗菌肽结构与活性的关系、抗菌肽作用机制及其基因表达调控机制认识的不断深化,一种高效的、有利于人类健康的抗菌肽作抗生素替代品成为现实。蚕抗菌肽在医学上已被开发利用，如已用于治疗肾炎的“肾肝宁”及批准作西药Ⅱ类进行临床观察的乙型肝炎新药，而以抗菌肽作为消洗剂、治疗胃十二指肠溃疡及消化道炎症的新药正在进行。蛙皮肤上有许多腺体，能产生许多种类的生物活性肽，其中Magainin抗菌肽已经基因工程的方法合成Magainin (马盖宁)新药。
     3.3蚕抗菌肽的基因工程研究抗菌肽具广谱抗菌活性，但在正常动物体中含量少，给其应用带来了困难。至今研制和应用的抗菌肽，均是从免疫蚕蛹中提取的，而柞蚕蛹免疫血清中抗菌肽的含量很低，提取价格昂贵。为能降低抗菌肽的生产成本，进行大规模工业化生产，已人工设计合成抗菌肽D、BD及AD基因，并成功将其导入酿酒酵母及毕赤酵母中进行表达。
     4抗菌肽作饲料添加剂应用的优势
     抗菌肽能耐受饲料制粒时的高温。规模化发酵生产抗菌肽时经高温浓缩工序，可充分杀灭酵母菌体而不导致抗菌肽失活，产品在推广应用后不会出现工程菌的扩散而导致环境生态问题。抗菌肽杀菌机理独特，病原菌不易对抗菌肽产生耐药性，以工程菌工业化发酵生产抗菌肽，可大规模生产，生产周期短，生产成本低且不受季节和气候变化等外在环境的影响。再者，抗菌肽产品具广谱抗菌作用，对畜禽具促生长、保健和治疗疾病的功能，属无毒副作用、无残留、无致细菌耐药性的一类环保型制剂。
     总之，抗菌肽有着独特的不同于抗生素的抗菌机理,它广泛存在于多种生物体内,是生物体对外界病原物侵染而产生的一系列免疫反应的产物，具有较强的广谱抗菌能力。寻找各种动物内源性抗菌物质，以现代生物技术方法工业化生产这些在抗病原菌上具有动物“种”专一性或特异性的系列产品，必将成为替代抗生素的新型饲料添加剂。