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孙金福1，卫广森2

(1. 沈阳生物技术研究所，辽宁 沈阳 110034；

2.中农威特生物科技股份有限公司，甘肃 兰州 730046)

中图分类号 Q789 文献标识码 A 文章编号 1672-9692(2005)05-0045-02

[摘 要] DNA疫苗以其独特优点而倍受青睐，但免疫效力较低制约着其广泛应用。本文从佐剂的使用、优化表达载体、优化抗原基因等方面综述了提高DNA疫苗免疫效力的策略，并对DNA疫苗前景进行了展望。

[关键词] DNA疫苗；免疫效力

基因疫苗既有类似减毒活疫苗的优点—可持续诱导体液免疫和细胞免疫，又具有灭活疫苗或亚单位疫苗的安全性—不存在疫苗返祖、毒力增强的危险[1]。与常规疫苗相比，基因疫苗还具有良好的热稳定性，易于生产等诸多优点，因此倍受青睐，被誉为疫苗发展的一次革命。目前，提高基因疫苗免疫应答水平是基因免疫研究领域的热点之一。

1 使用免疫佐剂，提高DNA疫苗免疫效力

1.1 传统铝盐佐剂 Ulmer JB等[2]用铝盐佐剂和DNA疫苗同时接种鼠、豚鼠，DNA疫苗诱导的抗体反应提高了1倍，接种非人灵长类动物抗体反应提高50%～100%。Temperton NJ等[3]将人巨细胞病毒（HCMV）糖蛋白B(gpUL55)DNA疫苗与磷酸铝胶佐剂乳化后免疫BALB/c小鼠，gpUL55特异性抗体反应显著提高。试验结果说明，铝胶佐剂并没有影响质粒DNA对抗原的原位表达水平，而是在原位表达后对抗原起到积极影响作用。

1.2 免疫调节剂 Sasaki S等[4]用Ubenimex(UBX,Ubenimex，乌苯美司，是一种抗癌免疫调节剂)作为佐剂，加入编码HIV-1 B株env和rev基因的质粒DNA，共同肌肉接种BALB/c鼠。混合接种小鼠血清特异性IgG滴度比无佐剂组高3～5倍。结果表明，UBX介导了免疫调控机制，并诱导辅助性T细胞1亚群的活化。

1.3 基因佐剂 白细胞介素、干扰素等细胞因子对免疫细胞的活化、增殖、成熟、分化及免疫细胞功能发挥具有重要作用，构建白细胞介素、干扰素等细胞因子表达质粒、B7共刺激因子表达质粒及富含CpG寡核苷酸序列的质粒等作为基因佐剂与DNA疫苗共免疫，或将其表达基因与抗原基因构建成共表达质粒，能够显著提高DNA疫苗的免疫效力。

1.3.1 白细胞介素基因与目的抗原基因共表达 Inoue等[5]用表达单纯疱疹病毒I型(HSV-1)糖蛋白D(gD)的质粒pHSDneo1和表达嵌合基因gD-IL-2(gD和人IL-2)的质粒pHDLneo1分别结膜下二次注射免疫BALB/c鼠，然后用CHR3株攻击。结果显示，嵌和基因疫苗GD-IL-2 D诱导了更高水平DTH和更有力的CTL活性。

1.3.2 白细胞介素表达质粒与DNA疫苗共免疫 Zhu M等[6]将IL-18表达质粒和HSV-1糖蛋白D DNA疫苗共同免疫小鼠，与HSV-1糖蛋白D DNA疫苗单独免疫组对照，联合免疫组血清IgG2a/IgG1比例和Th1细胞因子（IL-2和γ-IFN）显著增加，IL-18表达质粒有效提高了抗原特异性淋巴细胞增殖和迟发型超敏反应。角膜攻毒感染，IL-18表达质粒共免组角膜损害轻微且恢复较快，保护显著优于对照组。

1.3.3 共刺激因子B7-2表达质粒与DNA疫苗共免疫 B7-2共刺激因子能够增强T细胞免疫反应。王延军等[7]用B7-2表达质粒和表达HBV preS2+S蛋白的DNA疫苗腓肠肌注射共免疫鼠，分析了B7-2表达质粒对DNA疫苗免疫效果的影响。结果显示，B7-2表达质粒和HBV preS2+S DNA疫苗共同免疫大大提高了DTH反应和CTL活性（P<0.01）,但抗体滴度无显著差异（P>0.05）。这表明B7-2表达质粒提高了HBV DNA疫苗诱导的HBV特异性细胞免疫反应。

1.3.4 富含CpG基元质粒与DNA疫苗共免疫 含未甲基化的CpG基元的合成寡脱氧核苷酸（ODN）能够激发以B细胞、NK细胞和单核细胞/巨噬细胞活化为特征的免疫反应。Kojima Y等[8]将5～20个外源CpG基元分别克隆入PUC衍生质粒。用此富含CpG质粒分别体外处理骨髓源树突状细胞（BM-DCs），增强了CD40、CD86活化标志—MHCⅡ类分子的表达。用富含CpG质粒与表达HIV糖蛋白的DNA疫苗共免疫BALB/c鼠可显著提高HIV特异性细胞免疫和体液免疫，表明含多重CpG基元的质粒可以提高DNA疫苗的免疫原性。

2 优化表达载体，提高DNA疫苗免疫效力

优化表达载体主要是指针对宿主和外源基因的特性选择适宜的真核表达载体、优化基因表达调控元件，通过提高基因转录水平、增强转录后mRNA稳定性及运输效率等策略，达到提高DNA疫苗免疫效力的目的。

2.1 选择强启动子，增强抗原基因转录 DNA疫苗诱导的免疫反应的强度与目的抗原的表达量直接相关，选择较强启动子有利于提高目的抗原蛋白的表达量。

David L.等[9]研究了不同载体、不同启动子对目的抗原基因表达的影响。他们将禽流感病毒HA基因分别克隆入含不同启动子的5种表达载体，构建HA基因重组表达质粒，分别是：含人巨细胞病毒早期启动子(CMV)pCI-neo质粒、含猴病毒40早期启动子（SV40）pSI质粒、含CMV启动子VR1012质粒、含鸡β肌动蛋白启动子载体pCAGGS质粒、含Rous肉瘤病毒(RSV)LTR启动子pRC/RSV质粒。体外转染水貂肺上皮细胞和鸡胚成纤维细胞实验表明，只有pCI-neo HA重组质粒在两种细胞较强表达HA蛋白。动物免疫和攻毒试验显示，只有pCI-neo HA重组质粒诱导了抗体产生并提供了良好的保护。

2.2 优化调控元件，提高抗原mRNA的运输效率 抗原mRNA的出核运输效率直接影响抗原蛋白的翻译水平，因此，构建含有能够促进mRNA输出的前导序列和转录后元件的质粒载体是提高DNA疫苗免疫反应的方法之一。

Locher CP等[10]评价了含有血纤维蛋白溶酶原激活因子（TPA）前导序列和猴反转录病毒基本转运元件（CTE）的pND-14、含有乙型肝炎病毒转录后调控元件（PRE）的pCMV-link及最小表达载体pVAX1三种不同哺乳动物表达载体对HIV-2 Env gp140基因表达效率的差异。研究发现，pVAX1体外表达gp140水平（5 ng/ml）比pCMV-link、pND-14低3～4倍；用pCMV-link、pND-14皮内免疫鼠，发现pND-14比pCMV-link诱导产生了更高水平的Env特异性系统和黏膜抗体。由此得出结论，DNA疫苗表达载体中含有TPA和CTE序列，能够提高DNA疫苗免疫反应。

3 优化抗原基因，提高DNA疫苗免疫效力

3.1 优化抗原基因密码子，提高翻译水平 密码子使用频率的种间差异是影响DNA疫苗产生有效特异性免疫应答的主要因素之一。Kozak[11]发现，mRNA上起始密码子的侧冀序列的结构可影响真核生物核糖体识别AUG的效率。哺乳动物细胞高效表达基因的mRNA 起始部位的序列为(CCG)CCA/GCCAUGG，具有高度保守性，系统突变分析表明，该序列+4位的G和-3位的A(或G)极为重要,两者中任一碱基发生改变，均可使翻译效率降低5～10倍。很多病毒基因遗传密码的使用频率与宿主细胞的偏爱性有很大差别，使得直接利用天然抗原基因构建DNA疫苗时，目的抗原的表达水平较低。因此，必要时应根据Kozak规则[12]，对抗原基因进行密码子优化，以提高目的抗原的表达量和免疫反应的强度。

3.2 修饰抗原基因，增强抗原蛋白的免疫原性 对抗原基因进行修饰，如将抗原基因与HSP70、LLO（李斯特菌溶胞素O）等相连，构建嵌合基因，融合表达抗原蛋白，可大大增强目的抗原的免疫原性。

Chen CH等[13]为进一步提高DNA疫苗效力，将结核分枝杆菌热休克蛋白70（Hsp70）与人乳头瘤病毒16型E7基因相连接，构建表达E7/Hsp70融合基因的DNA疫苗。结果显示，用含E7/Hsp70融合基因的DNA疫苗免疫鼠产生CD8+T细胞的频率比天然型E7基因疫苗至少高出30倍。这些结果表明，Hsp70与抗原基因融合可以显著提高DNA疫苗效力。

3.3 优化抗原基因功能区，提高抗原蛋白的免疫原性 抗原基因的不同功能区有时对基因疫苗的免疫应答有很大影响，对抗原基因功能区进行优化组合、修饰，改变抗原蛋白的胞内定位（细胞外、细胞膜表面锚定或细胞内）和抗原蛋白的表位结构，有利于增强抗原信息的递呈能力和抗原蛋白的免疫原性。

余兴龙等[14]在构建猪瘟病毒(CSFV)主要保护性抗原E2基因疫苗时，根据E2基因上不同的功能区特征，构建了四种真核表达质粒，其编码E2基因的范围分别是：pcDST，有信号肽有跨膜区；pcDSW，有信号肽无跨膜区；pcDWT，无信号肽有跨膜区；pcDWW，无信号肽无跨膜区。动物免疫试验表明，无信号肽的两种质粒pcDWT、pcDWW不能诱导CSFV特异性的免疫应答，有信号肽序列的E2基因可诱导产生特异性免疫反应。而且，无跨膜区序列的pcDSW诱导小鼠产生抗CSFV特异性抗体水平,较有跨膜区序列的pcDST高。动物保护试验亦表明pcDSW较pcDST所诱导的保护力强。作者分析由于E2基因是糖蛋白，缺乏信号肽E2蛋白不能成熟，从而可能影响其抗原性。另外，肌肉注射质粒DNA后，肌细胞表达的抗原蛋白若有跨膜区，将结合于肌细胞膜上不利于抗原信息的传递；反之，若肌细胞表达无跨膜区的抗原蛋白，则抗原蛋白将分泌到肌细胞周围，然后随组织液、淋巴液甚至血清向四周扩散，有利于将抗原信息传递给免疫系统。

4 DNA疫苗展望

DNA疫苗以其独特的优点开创了疫苗研究的新时代。基因疫苗能够激活强有力的CTL活性，使得慢性感染性疾病和肿瘤的治疗成为可能；对于高变异性的病原微生物，可以利用其保守的核蛋白基因制备DNA疫苗来进行预防；高致病力病原微生物疫苗的制备与应用安全问题，也将随着DNA疫苗的研制与发展而得到解决。事实上，目前已经在这些方面取得喜人成果。随着基础研究和应用研究的深入，DNA疫苗免疫机制和免疫效力方面存在的问题将最终得到解决，DNA疫苗也必将取代传统疫苗，真正迎来疫苗应用的新时代。

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[14]余兴龙、涂长春、李红卫等.猪瘟病毒E2基因真核表达质粒的构建及基因疫苗的研究.中国病毒学,2000,15(3):264～271.